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Análise da Influência do número de cópias na expressão do gene blaKPC
(2021-03-05) Oliveira, Michelly Maria Pereira e; Almeida, Anna Carolina Soares; http://lattes.cnpq.br/4153747599532886
As enterobactérias tem se destacado na prática clínica pela detecção de mecanismos enzimáticos que conferem resistência a antimicrobianos, destacando-se a Klebsiella pneumoniae carbapenemase (KPC) devido a sua rápida disseminação mundial ocasionada pela localização do gene blaKPC em grandes plasmídios transferíveis e transposons. A expressão do gene blaKPC pode ser afetadas por características intrínsecas do hospedeiro que o abriga ou número de cópias. Um fenótipo não usual foi observado em isolados clínicos de P. stuartii e M. morganii e seus respectivos transformantes, onde as células de E. coli receptoras de plasmídeos que carregavam o gene blaKPC, apresentaram valores de CIMs, para alguns beta-lactâmicos, maiores do que nos isolados clínicos. O objetivo deste trabalho foi analisar o número de cópias do gene blaKPC, relacionando-os com seus os respectivos CIMs. O DNA genômico dos isolados bacterianos foi extraído a partir do kit PromegaTM WizardTM Genomic DNA Purification conforme orientações do fabricante, e em seguida, foi quantificado por espectofotometria através do equipamento NanoDropTM Lite da Thermo Fisher Scientific. Os genes de controle endógenos foram escolhidos a partir da literatura depois de uma busca robusta, em seguida foram analisados in silico. Utilizando bancos de dados, softwares e outras ferramentas, os primers foram desenhados. Para a realização da quantificação absoluta, foi realizada uma estimativa baseada em uma proporção da relação quantitativa relativa entre alvo e o controle endógeno, utilizando a fórmula 2-ΔCq. Para os experimentos foi utilizando o equipamento SteponeTM Real-time PCR System (Applied Biosystems) e o corante SYBR Green PCR Master Mix (Applied Biosystems). Os primers desenhados passaram por uma etapa de validação visando avaliar sua eficiência (tufMm - 93.019, tufPs - 90.228 e tufKp - 103.474, ambos com R2próximos de 1). Os dados gerados pelos experimentos de qPCR absoluta foram associados com os distintos perfis fenotípicos observados e a partir dos ensaios foi determinado que o número de cópias do gene blaKPC para os isolados transformantes e para os isolados clínicos não variam significativamente, apontando que outro mecanismo deve estar interferindo na expressão do gene blaKPC, influenciando diretamente os níveis de resistência.
Atividade antimicrobiana de probióticos comerciais frente à enterobactérias prejudiciais ao homem
(2018) Santos, Larissa da Conceição; Costa, Cynthia Maria Carneiro; http://lattes.cnpq.br/9859547718446795; http://lattes.cnpq.br/1738865984772199
Os probióticos são suplementos de microrganismos vivos que conferem benefícios ao hospedeiro. Em decorrência de alguma alteração na microbiota intestinal, os probióticos são receitados na tentativa de reverter desequilíbrios provocados por possíveis bactérias patógenas oportunistas. Dessa forma, a fim de conhecer o potencial dos probióticos comercializados em farmácia, a saber: Saccharomyces cerevisiae (Floratil®)Saccharomyces boulardii(Florax®) Bacillus cereus(Biovicerin®)eBacillus clausii(Enterogermina®) objetivou-se quantifica-los em meio sólido e comparar com o fabricante, testar a atividade antimicrobiana dos probióticos individualmente, bem como a associação destes com Lactobacillussp. (Leite fermentado Isis®) em meio sólido e líquido frente às enterobactérias. A contagem de Unidades Formadoras de colônias (UFC/mL) foi realizada pela técnica de diluição seriada e semeio em placas de Petri com Ágar Nutriente (para bactérias) e Ágar Sabouraud (para leveduras). As placas de Petri foram incubadas a 30 ºC por 24 e 48 horas para o crescimento das bactérias e leveduras e posteriormente a quantificação das placas que apresentaram entre 20 e 200 UFC/mL. A atividade antimicrobiana foi avaliada a partir do crescimento dos probióticos individualmente e da associação destes com Lactobacillus sp. em meio sólido pela técnica de difusão em ágar, que consistiu em inocular discos de 15 mm na superfície do ágar Mueller Hinton onde se encontravam previamente semeadas, Escherichia coli, Salmonellasp. Klebsiellasp. e Citrobacter freundii.Também foi realizada a atividade antimicrobiana do crescimento dos probióticos individualmente em meio líquido, com extrato de cada probiótico em ágar Mueller Hinton com as bactérias testes previamente semeadas, além disso, a atividade dos probióticos também foi realizada pelo crescimento da associação desses com Lactobacillus sp. em meio líquido, em que a partir do crescimento deles, cada associado foi submetido a duas condições de tratamento colocando 5 mL do probiótico em dois tubos de Falcon (15 mL) onde um recebeu etanol (solvente polar) e o outro 5 mL de acetato de etila (solvente apolar) submetidos a três horas sob agitação, em seguida, de todos os tubos foram pipetados 20 μl do sobrenadante e inoculados nos discos os quais estavam sobre a superfície do ágar Mueller Hinton com as bactérias testes previamente semeadas. Todos os testes foram realizados em triplicatas, incubados a 37ºC, com resultados obtidos após 24 horas pela formação ou não do halo de inibição. Não houve atividadeantimicrobiana frente às enterobactérias testadas. Diversos fatores devem ser levados em consideração quando se trata da ação metabólica de microrganismos, nas condições, in vitro,testadas neste trabalho.